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Batman trata de detener una serie de robos y asesinatos cometidos por el Joker en Gotham. Sin embargo, el Joker ha encontrado una aliada en Harley Quinn, quien ha vuelto a su lado para ayudarlo a llevar a cabo su plan. Mientras tanto, Bruce Wayne ha estado entrenando a un nuevo protegido, Jason Todd, para que se convierta en el nuevo Robin. Trabaja en un nuevo proyecto junto a su amiga Barbara Gordon, alias Oráculo. La situación empeora cuando el Joker secuestra a Alfred y lo utiliza como rehén en su plan para desestabilizar la ciudad. Batman y Robin, junto a Nightwing deben enfrentar al Joker y a Harley en una batalla épica que podría definir el futuro de Gotham. A lo largo de la película, se muestran flashbacks que revelan la relación previa entre el Joker y Harley Quinn, así como también los traumas que Jason Todd y Barbara Gordon han sufrido antes de convertirse en los héroes que son ahora. La película llega a su clímax en una confrontación final en la que Batman y el Joker se enfrentan en una batalla a vida o muerte, mientras que Harley intenta detenerlosa. En medio del caos, Alfred pierde la vida a manos del Joker. La película termina con Batman y sus aliados vengando la muerte de Alfred, mientras que Jason Todd, afectado por la pérdida, decide abandonar el manto de Robin y busca venganza contra el Joker. Barbara Gordon, por otro lado, asume el papel de la Oráculo de forma permanente y trabaja junto a Batman para proteger a Gotham City de cualquier amenaza futura.